影响近红外光谱分析结果准确性的因素


(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院, 陕西 杨凌 712100 ;2.中国农业科学院农产品加工研究所, 北京 100094)

摘 要:本文论述了影响近红外分析准确性的各种因素, 着重分析讨论了标样的组分含量 、数量、样品的物性 、样品预处理方法、测试条件和仪器自身等因素对近红外光谱分析准确度的影响和预防措施, 为近红外光谱分析技术的广泛应用提供理论指导。
关键词:近红外光谱分析;影响因素 ;误差 ;准确度

AFFECTING FACTORS ON THE ACCURACY OF NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY ANALYSIS


LI Yong
1, 2
WEI Yi min
WANG Feng


 (1.Collage of  Food Science Technology  and Engineering , Northwest Sci-Tech University of  Agriculture and  Forestry , Yang Ling , Shaanxi , 712100 ; 2.Institute of Agro-Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing , 100094)

Abstract :This article discus es various factors that may affect  the  accuracy  of  analysis results by NIR Spectroscopy technique .Content of  ingredient  and quantity , physical  properties of  references and  samples ;test  conditions and instrumental factors are  reviewed  in terms of  influence  on the  result  accuracy  of  NIR spectroscopy  analysis .The precaution measures to avoid the influences during analysis are provided .
Key words:near infrared spectroscopy analysis ;influence factors ;error ;accuracy

近红外光谱分析技术以其快速 、简便 、高效等优势已被人们认识和接受。其应用范围也由谷物 、饲料扩展到食品和果蔬等领域[ 1] 。近红外光谱分析是在波长为 700nm ~ 2500nm 的谱区内利用有机分子某些官能团扭曲、拉伸等振动谐波及其组合带吸收与样品待测组分之间通过化学计量学的多元校正方法,   依靠样品间光谱信息的细微差别来对样品进行定量或定性分析的, 是一种物理的分析方法, 分析结果的准确性受多种因素影响[ 2] 。因此了解近红外光谱分析的各种影响因素, 是保证测试结果准确的前提条件。本文较为系统地讨论了影响近红外分析结果的各种因素及预防措施,   为近红外光谱分析技术的更加广泛应用提供理论指导。
影响近红外测试结果稳定性的因素可分为三类:即源于仪器的影响因素 , 来源于样品的影响因素, 以及与操作者自身有关的因素(见表 1)。这些因素主要来自定标样品的选择 、模型传递过程中波长的变化 、样品预处理及装样的差别、定标样品的标准方法测定 、测试条件 、样品特征等。
现就主要影响因素及消除方法分述如下:

1 定标样品的选择和数量


1.1 定标样品组分待测含量范围
待测组分含量范围决定模型适应性好坏。定标样品组分含量范围一定要尽量的宽,  这样才能保证以后待测样品的近红外预测值不会出现异常或比较大的偏差;如果组分含量未知, 则最小浓度范围为标

准方法测量误差的十倍。即若 :滴定法为标准方法 , 滴定误差是 ±0.3 个单位, 则测量的浓度范围应该在3(0.3 ×10 =3)个单位左右[ 2]  。若样品组分两端出现比较明显的极值, 且样品量很少, 需要将此样品剔除, 不能参与定标。直到积累有比较多的此类极端样品后, 将他们一同加入到定标集中, 对原模型进行升级。
表 1   影响近红外光谱分析结果的因素
来源于操作者来源于样品来源于仪器
○ 定标过程中的差异○ 组分间的相互干扰○ 波长的准确性
a 标样数量○ 化学组分对物理性状的影响○ 光谱的分辨率
b 标样的选择○ 材料的水分含量○ 波长的重现性
c 基础数据分析准确性○ 样品及测试环境的温度○ 温度控制系统
○ 样品的预处理方法○ 样品粒度、堆密度○ 样品盒差异
a 制样方法○ 样品的质地、色泽及生长条件○ 吸光度的准确性
b 样品的均匀度○ 全籽粒谷物的分析○ 吸光度噪音
○ 样品的储存方式a 籽粒大小;b  波程长短;○ 基线的稳定性
○ 样品的装样差异c 进样方式;d  水分含量;○ 电源的稳定性

e 温度;f 色泽;g 杂质○ 软件处理功能

1.1 定标样品分布
在样品数量较多的情况下, 定标样品的选取最好服从“ 均匀”(boxcar)分布 , 也就是说定标样品不应该成簇地只集中在某一部分浓度范围, 而是尽量均匀地覆盖整个待测组分含量的变化范围;同时也要尽量避免样品的正态分布。选择定标样品可基于样品的光谱特性, 如ISI 和WINISI 软件(Fos  公司)利用
样品光谱之间的相似程度来选取样品, 其效果优于浓度选取方法[ 2] 。
1.2 定标样品的来源
理想的定标样品来源应包含以后所有可能测定的样品。因此,   样品的来源对天然产物要考虑其生长气候、生长条件、品种、 质地、收获季节等 ;对在线检测要包括各个工艺条件下的样品 。
1.3 定标样品数量
定标样品的数量直接影响分析的准确性。数量太少, 不足以反映待测样品的群体常态分布规律, 数量太多将增加分析和筛选的工作量。在实际工作中, 建立较窄范围模型需要 50 ~ 100 个定标样品, 对于
较宽范围或开放样品群则需要至少 150 个以上的定标样品[ 3] 。
总之, 定标集样品选择一定要有代表性, 所谓代表性也就是说定标样品这个小群体从待测组分含量, 样品水分含量到样品来源等都要代表待测集这个大群体。也可形象地描述为先定边疆, 然后在此域内搜集异质样品。

2 定标样品物理性状


2.1 样品的粒度
样品粒度大小及其分布是影响近红外预测效果的重要因素之一。样品粒度的差异直接影响样品对


近红外光的吸收和散射, 从而导致光谱的变异。对此近红外光谱专家们做了大量工作,Willimas、Thompso分别指出影响近红外光谱分析准确性和精确性最重要的因素是样品的颗粒度。1984 年Norris


和Willimas[ 6] 研究了颗粒度大小对硬红冬小麦近红外测试结果的影响, 发现不同颗粒度大小样品的近红外光谱有很明显的差异, 随样品颗粒度的增大, 吸光度增加, 且波长越长, 光谱变异越大。1999 年Wang 和Dowell 等[ 7] 研究了全籽粒小麦的籽粒大小对近红外光谱的影响, 发现颗粒度大小与吸光度成正相关, 红小麦相关系数为 0.77 , 白小麦相关系数为 0.72 。国内在这方面也有研究, 王文真[ 8] 验证了样品粒度对近红外测定结果的影响, 得出小麦中粗蛋白含量的预测值随粒度的增大而增高;且待测样品粒度和定标样品粒度相接近的预测值与实际值最为接近。胡新中等[  9]   研究了小麦全粉粗细度对近红外测定结果的影响, 发现随粒度的增加, 蛋白质含量 、水分含量和硬度的近红外预测值都有所增加 。陆婉真等[ 1] 认为随样品颗粒度的增加, 漫反射吸光度增加, 测量光谱重现性变差, 测量光谱的波动性随粒径的增加呈指数增加。赵枝新等[ 10] 研究发现玉米的定标粒度显著地影响测定玉米粗蛋白的含量。

粒度大小的不同往往会出现不同的测量结果, 甚至会出现很大的偏差。这是因为样品粒度大时, 其光学表面粗糙, 影响反射光谱和传感系统呈现的透射层的物理深度,  影响到感受系统对样品表面的反应, 从而影响测试的灵敏度及准确度[ 11] 。研究表明, 光谱数据处理技术可有效的减少颗粒度对近红外光谱分析的影响[ 7] 。对光谱进行一次微分可消除光谱平移 ;对光谱进行二次微分可以消除光谱的旋转[ 12] 。另外降低样品颗粒度(但样品颗粒直径不能小于分析光的波长)或增加分析光直径都可以使分析光范围内样品颗粒度的物理状态的离散度下降,   从而降低源于颗粒度不均而引起的随机误差。严衍录[ 12] 等人在用近红外分析谷物时, 将谷物的颗粒度从通过 40 目筛降低为通过 60 目筛, 样品分析测定的标准偏差降低约 15 % 。分析光直径为 1 、1.5 和 4.8mm 时近红外漫反射光谱值的离散度以标准差表示分别为0.003 , 0.001 , 0.0006 反射吸光度单位。

保证粉碎粒度与定标时粒度的一致也是减少误差的另一有效途径[ 13] 。付秋娟[ 14] 等人利用通过 60
目筛的烟叶样品建立的模型分别对独立的 60 、40 、20 和 8 目烟叶进行预测, 发现预测 60 目的样品的预测值与真值最为接近。

2 样品的水分含量
待测样品的水分含量影响近红外光谱的形状。水分含量 10 %   ~ 30 %     的变化会导致其待测组分特征波长的偏移[ 15] 。Gaines [ 17]
而增大 Delwiche 和NorrisWindham 认为小麦漫反射的吸光度在所有的波长处都随水分含量的增大在考察近红外光谱吸收对淀粉和纤维的水分含量和水分活度的敏感性时,


发现相同水分活度, 不同水分含量的近红外光谱差别较大;相同水分含量不同水分活度的样品光谱无明
 显差异。Williams 和Thompson    利用水分含量分别为 9.2 %  、10.5 % 、12.3% 的小麦全麦粉, 分别建立定
标模型, 用来预测三种水分含量的小麦的蛋白质含量。发现用 9.2%水分的小麦所建模型预测 10.5%的小麦的蛋白质时, 预测值的平均值比标准的高 0.66 %   , 单个预测值最高偏差达 1%   ;用来预测高水分时(12.3 %), 平均预测值比标准高0.27 %   , 最大偏差达 1.6 % 。用高水分样品所建的模型预测低水分样
品的蛋白质含量, 结果比标准值偏低。最后得出小麦定标时最佳水分为 10.25 %   ~ 12.5 %  。Fales 和[ 18]Cummins 用同一回归模型对 21  个高粱青储饲料在 85 ℃烘箱干燥后分别于低湿度(43 %)、中湿度
(63 %)和高湿度(100 %)保存后对酸洗纤维(ADF)含量做预测, 发现干燥和低湿条件的SEP  分别为
%1.27 %和 1.18 %  。而中湿度和高湿度的样品预测标准偏差(SEP)分别为 2.28 % 和 4.15 %   。水分含量对饲料中的ADF 含量的预测值影响非常明显。胡新中等[ 9] 利用同一预测模型对不同水分含量的小麦蛋白质进行预测, 发现随水分含量的增加, 蛋白质含量下降, 极差为 2.1    。王京宇[ 19] 用两个预测模型研究水分对其它组分预测值的影响, 结果一个模型影响显著, 另一个不显著, 但没有从理论上阐明原因。
水分对近红外分析结果产生影响主要有以下几个原因 :一是样品的水分含量显著地影响粉碎后颗粒度的大小 、形状及其分布, 导致样品光谱散射系数S 发生变化, 从而影响其预测结果。其二是通过与其它成分的水合作用, 导致某成分最佳波长点发生漂移。
为减少水分对近红外预测值的影响, 一是定标时使样品保持在稳定的 、自然状态下的水分含量[ 20] ;
二是保证待分析样品水分含量与建立模型时条件相一致。三是采用多水分层次进行定标,   使水分参与模型的回归, 建立水分全局定标模型, 减少由于水分的差异所带来的测量误差。
1.2 样品的颜色
样品表面的色泽影响样品对近红外光的漫反射率和透过率的大小。一些表面比较光亮的样品,         对光的反射比较强烈, 这样就导致近红外光不能携带样品信息到达检测器 ;相近组分, 不同颜色的油菜籽样品近红外扫描实验中, 样品表面颜色越深, 吸光度越大, 在短波处(≤1000nm)最为明显[ 2] 。一般颜色差异比较大的样品需要根据颜色分类, 按类分别单独定标。
1.3 样品中的杂质含量
谷物在收获 、运输、贮藏过程中难免会混入杂质, 这样在分析过程中就会有像稻草、谷壳、沙子 、草籽等杂质影响近红外的有效波程长。Williams 和Norris 在小麦中加入稻草、谷壳等杂质 , 当其超过 7.5时, 所测蛋白质含量增加 0.5 %  。而其中小籽粒杂质影响最为明显。在透射式近红外谷物分析仪的实验中, 如果小籽粒杂质含量达 10 %时, 蛋白质含量的预测值会高出七个百分点。因此在近红外谷物品质分析前, 必须将杂质清理干净。

1 定标样品的化学方法测试

由于近红外分析方法属于二次分析方法, 所以其预测效果的好坏直接取决于经典方法测试的准确性。近红外预测结果的准确性永远小于定标时的经典方法, 一般误差是标准方法的 1.5 倍左右。所以用于定标样品的化学测试必须是国际公认的方法或国标法, 每个样品做 2 ~ 3 个平行, 保证结果准确无误。

2 样品的测试条件

2.1 测试温度
近红外光谱是分子的能量光谱, 因此任何温度的变化都将改变光谱的形状, 从而影响近红外光谱分


析结果的准确性[ 21] 。在较低或较高温度下的分析结果会有较大的偏差。1982 年
Williams 利用近红外


漫反射对小麦进行研究表明, 在室温条件下建立的分析模型预测 -10 ℃的小麦样品 , 蛋白质含量比真实值要高1.0    , 预测 40 ℃的样品结果比真实值偏低 0.5 %   , 并且在从 -30 ℃至 40  ℃的连续升温的过程中蛋白质含量成线性下降。1985 年Williams 和Norris 利用透射光谱分析了小麦和大麦的蛋白质和水分含量, 在未用温度补偿系统时, 当样品温度从 -23 ℃至 45 ℃的升温过程中小麦蛋白质的预测标准偏差
(SEP)为 2.84 %  , 水分的 SEP 为 0.49 %  , 当使用温度补偿系统时, 蛋白质和水分的 SEP  分别降低到0.34 %和 0.26 %  。温度影响近红外分析结果的主要原因有以下几方面:一方面是由仪器本身引起的, 近红外分析仪的检测器对温度特别敏感。另一方面是源于样品本身, 样品内激发态分子的数目是温度的函数, 而不同的吸收谱带又起因于未被激发的基态分子对光的吸收,    且吸收强度和位置的变化也是通过温度对偶电常数和缔合影响引起的[ 23] 。

解决温度对近红外分析结果的影响主要有以下几个办法 :①通过计算机选择对温度不敏感的样品特征波长点来建立样品的定量分析模型, 这样的模型对温度比较稳定[ 6] ;②将样品温度调整至与定标时样品温度相等后再进行上机测试;③将同一样品在不同的温度下进行扫描 , 通过特定的软件计算出温度补偿系数校正;④在建立定量分析模型时 , 最好在不同的温度下扫描样品光谱, 使建模温度范围包含日常使用时的测量范围,  把温度作为建立模型的因素之一,  这样建立的模型就具有温度的自动矫正功能[ 24] 。

2.2 取样的均匀性
样品的均匀程度是近红外光谱分析方法中非常重要的一个内部因素。以谷物为例,     其均匀度包括
磨样时粒度的均匀性, 样品内水分的均匀性,  样品表面的平整性, 脱壳的一致性等。这些在样品的制备
[ 12]
过程中稍加注意就很容易做到。严衍禄等 在实验中发现通过旋转样品池可以十分有效的减少样品
的不均匀性,  用样品旋转台比无旋转台预测蛋白质含量的离散度降低一半以上,  可大大提高测量的精确度。

3 仪器的稳定性

仪器本身的不稳定也会引起测定误差, 如仪器的噪声 、基线的漂移 、波长的准确性等。为了减少这类影响应注意下列几点:①配置稳压电源 ;②开机预热至仪器恒温系统充分稳定 ;③保证合适的测试环境温度;④经常用标准物质校正波长的准确性 , 防止漂移。由于近红外光谱分析技术具有无污染、低消耗 、非破坏性 , 可实现多组分同时测定及分析速度快等优点。经四十余年的发展, 近红外技术广泛应用在农业 、食品、石油、制药、纺织等领域并取得较大进展。
近几年这项技术应用到工业过程的在线控制和质量控制并愈发显示其优越性。但是,   任何技术都有其不足之处, 应当了解近红外光谱分析的各种影响因素,  充分掌握该类仪器的优缺点,  才能发挥近红外光谱仪器的最大潜能, 为科研和生产服务。

参考文献:
[ 1 ] 陆婉珍, 袁洪福, 徐广通, 强冬梅.现代近红外光谱分析技术.北京:中国石化出版社, 2000
[ 2 ] Philip Williams, Karl Norris .Near infrared Technology  in the agriculture and  food industries .AACC , inc .St , MN USA , 2001
[ 3 ] 王之安.AOAC 公定分析方法.北京:中国科学技术出版社, 1991
[ 4 ]   Williams P C .Application of near infrared reflectance spectroscopy to analysis of cereal grain and oilseed .Cereal Chemistry , 1975 , 52 :561 ~ 576
[ 5 ] Williams  P C , Thompson  B N .Inf luence of Whole meal granularity on analysis of HRS wheat for protein and moisture by near inf rared reflectance spectroscopy .Cereal Chemistry , 1978 , 55(6):1014 ~ 1037
[ 6 ] Norris K H , Williams  P C .Optimization  of mathematical treatment of  raw  near  infrared  signal in  the measurement of protein in hard red  spri ng wheat .I.Influence of partical size.Cereal Chemist ry, 1984, 61(2):185 ~ 165
[ 7 ]   Wang D , Dowell F E , Lacey  R E .Single wheat kernel size effects on  near infrared ref lectance spectra and color classifi cation .Cereal Chemistry , 1999 , 76 (1):34 ~ 37
[ 8 ] 王文真.样品粒度对近红外分析结果的影响.分析仪器, 1993(2):52 ~ 54
[ 9 ] 胡新中, 魏益民, 张国权.近红外谷物品质分析仪工作稳定性研究.粮食与饲料工业, 2001(6):46 ~ 47
[ 10] 赵枝新, 金岭梅.粉碎粒度对近红外分析仪测定饲料样品干物质和粗蛋白含量的影响.中国饲料, 2002(3):35 ~ 37
[ 11] 卢利军, 庄树华, 李爱军.应用近红外技术测定黄豆粕中水分、蛋白、粗脂肪.分子科学学报, 2001 , 17(2):115 ~ 120
[ 12] 严衍禄, 景茂, 张录达, 王万军.傅立叶变换近红外漫反射光谱分析测量误差的研究.北京农业大学学报, 1990(16):37 ~ 48
[ 13] 王文真.在近红外定量分析中应注意的问题.现代科学仪器, 1996(1):24~ 25
[ 14] 付秋娟, 李义强, 束如欣, 葛 炯, 刘  伟.傅立叶变换近红外光谱仪分析技术在烟草行业中的应用.傅立叶红外光谱仪技术及应用论文集, 2004
[ 15]   Williams  P C, Norris K H , Sobering D C .Determination of protein and moisture in wheat and barley by near inf rared transmission .J .Agric Food Chem , 1985, 33 :239 ~ 244
[ 16]   Gaines  C C , Windham  W  W .Eff ect of wheat moisture  contend  on  meal apparent  particle  size  and  hardnes   score  determined  by  near-inf rared
reflectance  spectroscopy .Cereal Chemistry , 1998 , 75(3):386 ~ 391
[ 17]   Delwiche S  R, Ditt R E , Norris K H.Sensi tivity of near infrared absorption to moi sture content versus water activi ty in starch and cellulose .Cereal Chemist ry, 1992, 69(1):107 ~ 109
[ 18]   Fales S  L, Cummins  D G.Reducing moisture-induced  error  associated with  measuring forage  quality  using near  infrared  ref lectance .Agronomy Journal, 1982, 74 :585 ~ 588
[ 19] 王京宇, 郑家丰.水分含量对近红外测定蛋白质结果的影响.粮食与饲料工业.2001(10):48~ 49
[ 20]   Williams  P C, Sigurdson  J T .Implication of moisture loss in grains incurred during  sample preparation .Cereal Chemi stry , 1984 , 61(2):158 ~ 165
[ 21]   Williams  P C , Norris K H, Zarowski W S .Influence of temperature on  estimation  of protein and moisture in wheat by near infrared  reflectance .
Cereal Chemistry , 1982 , 59(6):473~ 477
[ 22] 彭玉魁, 李菊英, 祁振英.近红外分析技术在饲料工业中的发展.饲料工业, 2000, 21 , (2):21 ~ 23
[ 23] 冯新泸, 史永刚.近红外光谱及其在石油产品分析中的应用.北京:中国石化出版社, 2002
[ 24]   Florian W , Wim T K , Age K S .Inf luence of temperature on vibrational spectra and consequences for the predictive ability of multivariate models.
Anal Chem, 1998, 70 :1767 ~ 1767


service@china-ias.com
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————
工作时间:08:30—17:30
联系电话:0510-81002996
江苏省无锡市菱湖大道200号
中国传感网国际创新园G1-1006